Пульс-электрофорез и методы работы с большими молекулами ДНК
Введение
Метод пульс-электрофореза дает возможность разделять ДНК индивидуальных хромосом дрожжей и простейших. Размеры этих молекул варьируют от 0,2 до 10x106 нуклеотидных пар. В настоящее время создана технология выделения и обработки ДНК таких больших размеров как для эукариот, так и для прокариот. Таким образом, теперь существует возможность изучать целые хромосомы, последовательности ДНК которых насчитывают несколько миллионов оснований. Получены физические карты больших районов некоторых хромосом млекопитающих и целой хромосомы Esherichia coli. Цель этой работы – рассказать о биохимических методах, используемых при выделении больших молекул ДНК, и методах ПЭФ, применяемых для их анализа.
1. Приготовление образцов ДНК
Препараты ДНК с очень большой молекулярной массой невозможно получить, используя традиционные методы растворения, поскольку такие молекулы очень чувствительны к сдвиговым усилиям. В основе их – огромное осевое отношение молекул ДНК. Например, человеческая хромосома 21-самая маленькая в геноме. Ее ДНК насчитывает 50х10 п. н.и представляет собой единственную молекулу длиной 15 мм. Между тем диаметр этой молекулы всего 20 нм. Таким образом, осевое отношение составляет 10.
Для предотвращения разрушительного воздействия сдвиговых сил процедуру экстракции ДНК из клеток проводят в присутствии агарозы. Этот прием достаточно прост, и получаемые таким способом образцы можно затем использовать в традиционных электрофоретических опытах и экспериментах по клонированию. Живые клетки суспендируют в расплавленной низкоплавкой агарозе. Затем агарозе дают застыть в формочках объемом 100 мкл для формирования блоков, называемых вставками. Формочки можно приобрести у фирмы Pharma-cia-LKB или сделать самим, соединив вместе «хвост к голове» обычные гребенки для электрофореза нужных размеров. Все манипуляции с формочками следует проводить так, чтобы предотвратить их загрязнение нуклеазами. Перед употреблением формочки необходимо тщательно промыть дистиллированной водой и вытереть, одев перчатки. Затем одна сторона формочки заклеивается лентой, используемой в качестве донышка.
В качестве альтернативы агарозным блоквставкам могут выступить агарозные гранулы. Для их получения клеточную суспензию в агарозе по каплям добавляют в масло с одновременным перемешиванием. Размеры гранул контролируются скоростью перемешивания. С образцами ДНК в гранулах можно обращаться так же, как с растворенными. Однако мы предпочитаем использовать агарозные вставки, так как с ними проще работать.
Для выделения ДНК из клеток, лишенных клеточной стенки, поместите заполимеризовавшиеся агарозные вставки в раствор ESP и инкубируйте 2 дня при 50°С. В этом растворе происходит лизис клеток и отделение белков и других молекул от ДНК. Интактную хромосомную ДНК можно анализировать с помощью ПЭФ непосредственно из раствора ESP. Образцы ДНК в растворе ESP хранятся неопределенно долго при +4°С или даже при комнатной температуре прямо в пробирках Эппендорф.
При наличии клеточной стенки ее необходимо удалить перед экстракцией ДНК, поместив клетки в раствор ESP. Методики выделения ДНК из клеток с интактной стенкой представлены в табл. 4–6. ............
