ПОЛУЧЕНИЕ МЕМБРАННОГО БЕЛКА БАКТЕРИОРОДОПСИНА, МЕЧЕННОГО ДЕЙТЕРИЕМ ПО ОСТАТКАМ АРОМАТИЧЕСКИХ АМИНОКИСЛОТ L-ФЕНИЛАЛАНИНА, L-ТИРОЗИНА И L-ТРИПТОФАНА.
@2006 г. О.В. МОСИН
Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 117571, Москва, проспект Вернадского, д. 86.
Биосинтетически получены препараты мембранного белка бактериородопсина, в которых природные ароматические аминокислоты L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан селективно замещены на их дейтерий-меченные аналоги. Это достигается путем культивирования штамма галофильных бактерий Halobacterium halobium ЕТ 1001 на синтетической среде, содержащей вместо природных аминокислот химически синтезированные L-[2,3,4,5,6-2H5]-фенилаланин, L-[3,5-2H2]-тирозин и L-[2,4,5,6,7-2H5]-триптофан. Представлены данные по культивированию H. halobium ЕТ 1001 на средах, содержащих дейтерий-меченные аналоги ароматических аминокислот и выделению дейтерий-меченного бактериородопсина. Анализ степени дейтерированности аминокислот гидролизатов бактериородопсина проводили методом масс-спектрометрии электронного удара после препаративного разделения их методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в виде метиловых эфиров дансил-аминокислот и бензилоксикарбонильных производных аминокислот. Показано, что в масс-спектрах производных аминокислот гидролизатов бактериородопсина присутствуют молекулярные ионы, которые соответствуют ароматическим дейтерий-меченным аминокислотам и практически отсутствуют их нативные немеченные аналоги. Полученные данные свидетельствуют о высокой эффективности мечения бактериородопсина в этих условиях.
ВВЕДЕНИЕ.
Ретинальсодержащий белок - бактериородопсин, выполняющий функции АТФ-зависимой транслоказы в клеточной мембране галофильных бактерий Halobacterium halobium , был выделен и детально проанализирован Остерхельтом в 1970 году [1]. Несмотря на то, что бактериородопсин в настоящее время довольно хорошо изучен, он все еще остается в центре внимания исследователей по целому ряду причин. Прежде всего, благодаря своей высокой светочувствительности и разрешающей способности, он широко используется в прикладных целях как биологический фотохромный материал [2]. Кроме этого, бактериородопсин весьма привлекателен, как модельный объект для исследований, связанных с изучением функциональной активности и структурных свойств мембранных белков в составе нативных энергопреобразующих мембран.
Компьютерная модель мембранного белка бактериородопсина из H. halobium
Для получения детальной информации о структуре полипептидной цепи мембранного белка в нативной мембране целесообразно селективно вводить в белок изотопные метки, которые позволяют использовать спектральные методы высокого разрешения, такие как спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [3], Раман и лазерная спектроскопия [4,5], инфракрасная (ИК) спектрометрия [6] и масс-спектрометрия (МС) [7]. В связи с этим особенно перспективны исследования с мембранными белками, селективно обогащенными стабильными изотопами, например, дейтерием по остаткам таких функционально важных аминокислот, как L-фенилаланин, L-тирозин и L-триптофан [8,9]. Это связано с тем, что указанные аминокислоты участвуют в процессе формировании хромофорного центра бактериородопсина и в его функционировании [10]. ............
