ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время используются несколько подходов в получении трансгенных животных. Наиболее широко распространен метод микроинъекций чужеродной ДНК (чДНК) в пронуклеусы зигот. Оптимальные условия для проведения микроинъекций в пронуклеусы зигот мышей описаны в работе Бринстера и соавторов (1994).
Величина вводимой ДНК может достигать 30 Mb. Интеграция нескольких копий (от 1 до нескольких сотен) экзогенной ДНК в геном происходит, как правило, в одном сайте в ориентации "голова к хвосту" или "голова к голове". При инъекции нескольких рекомбинантных конструкций, их встраивание в геном, также происходит в одном сайте.
Другой подход в получении трансгенных животных заключается в инфицировании ранних эмбрионов млекопитающих рекомбинант-нымиретровирусами. Недостатком этого метода является получение трансгенных животных с мультисайтовой интеграцией трансгена и его нестабильной наследуемостью в поколениях.
Еще одним подходом в получении трансгенных животных является использование трансформированных чужеродной ДНК, эмбриональных стволовых клеток, путем инъекции последних в полость бластоцисты. Основным преимуществом данного метода является возможность проводить направленный мутагенез на уровне целого организма, при помощи гомологичной рекомбинации чужеродной ДНК с геномной ДНК.
Для получения трансгенных животных использовались и другие методы, к которым относятся: применение сперматозоидов, обработанных экзогенной ДНК, для оплодотворения яйцеклеток в условиях in vitro; использование липосом в качестве вектора чужеродной ДНК. Однако, эти методы имеют значительно менее широкое распространение, в сравнении с методом микроинъекции чужеродной ДНК в пронуклеус зиготы.
1. МЕТОДЫ ТРАНСГЕНЕЗА В ЖИВОТНОВОДСТВЕ
Трансгенные животные - это индивидуумы, в геном которых искусственно введена дополнительная генетическая информация (трансген). Такая информация представляет собой либо отдельный участок ДНК с собственными (гомологичными) регуляторными последовательностями (эукариотическая транскрипционная единица), либо сконструированный из различных молекул ДНК гибридный (рекомбинантный) ген. Таким образом, трансген - это искусственно введенный и интегрировавшейся в ДНК животных чужеродный ген. Под трансгенезом понимают процесс переноса и интеграции чужеродной генетической информации в геном животных.
1.1 Метод микроинъекции
Впервые о получении трансгенных сельскохозяйственных животных сообщили две лаборатории в США и Германии [Hammer et al, 1985; Brem et al., 1985]. В обоих случаях для переноса генных конструкций в эмбриональные линии был использован метод микроинъекции. Этот метод и сегодня остается наиболее широко используемым для трансгенеза в животноводстве.
Суть метода микроинъекции заключается во введении раствора генных конструкций в мужской пронуклеус зигот. Обычно инъецируют 1-2 пкл раствора ДНК в концентрации, соответствующей 1000 копиям в 1 пкл микроинъекционного раствора. При этом исходят из того, что количество 1000 копий/пкл приблизительно соответствует концентрации X нг/мкл, где X - длина генной конструкции в тысячах парах нуклеотидов (т.п.н). Например, если длина генной конструкции равна 10 т.п.н., то количество 1000 копий в 1 пкл будет достигаться при концентрации равной 10 нг/мкл.
Для более точного расчета концентрации генных конструкций используют следующую формулу:
Число копий (копий плк) = 6,023 *1023*С*10-9 /Mr, где 6,023*1023 - число копий в 1 М растворе;
С - концентрация ДНК [мкг/мл];
Mr - молекулярная масса [мг/моль].
Для расчета концентрации измеряют оптическую плотность раствора генной конструкции на спектрофотометре при длине волны 260 нм. ............
