Прыжки по хромосоме
Введение
В последнее десятилетие мы стали свидетелями целой серии ошеломляющих успехов в области молекулярной биологии. Разработка надежных методов клонирования, секвенирования и анализа экспрессии эукариотических генов углубила наши представления о структуре и регуляции активности гена, сделала более понятными механизмы многих наследственных болезней человека. В это же время быстро развивались и достигли значительных успехов методы картирования человеческих генов.
До недавнего времени существовал некий «провал» в области размеров хромосомных сегментов от 100 до 5000 т. п.н.; для них не имелось адекватных методов исследования. Такое положение значительно усложняло интерпретацию данных по картированию, полученных методами генетики соматических клеток и с помощью генетического анализа. Сопряжение таких данных с информацией, полученной на молекулярном уровне, стали называть «обратной генетикой».
В последние годы было предложено несколько подходов, позволяющих вести исследования в этой новой области. В настоящей работе описан один из них – метод «прыжков по хромосоме». С его помощью удается клонировать последовательности ДНК, значительно удаленные на генетической карте от последовательностей, гомологичных используемому зонду. Излагаются методики создания библиотек «хромосомных прыжков» и клонов-связок. Обсуждены преимущества и недостатки описываемого метода.
1. Область применения метода
Рис. 2 дает представление о размерах хромосомных сегментов, в пределах которых «работают» различные современные методы генетических исследований. Ось ординат представляет собой логарифмическую шкалу физических расстояний, измеренных в парах нуклеотидов. На шкале приведены и значения генетических расстояний, измеряемые в сантиморганидах. 1 см приблизительно равна 108 п.н. Однако это соотношение нельзя считать универсальным, ибо зависимость между генетическим и физическим расстоянием на хромосоме имеет нелинейный характер, на нее могут оказывать влияние «горячие точки» рекомбинации. Наличие таких областей может привести к ситуации, когда сравнительно большому генетическому расстоянию соответствует небольшой отрезок на физической карте. В то же время в геноме существуют участки, рекомбинация в которых маловероятна, а это приводит к обратной ситуации. Как показано на рис. 2, классические методы молекулярной генетики хорошо работают на последовательностях длиной до 50 г.п.н., что соответствует максимальному размеру вставки в космидный вектор. Участки большей длины можно клонировать путем «прогулки по хромосоме», когда, используя уже клонированные последовательности, геномную библиотеку скринируют с целью получения перекрывающихся клонов. Таким способом удаётся анализировать последовательности длиной до нескольких сотен т. п.н. Однако, в некоторых случаях эта процедура может занять очень много времени. Так будет, если какие-то участки практически не перекрываются из-за наличия протяженной области повторяющихся последовательностей или последовательностей ДНК, которые не удается ввести в стандартные векторы. Если известно, что интересующий нас ген находится на расстояний нескольких сотен т. п.н. от используемого клона, то применение метода «прогулки по хромосоме» весьма проблематично.
На противоположном конце спектра работают методы генетики соматических клеток, гибридизация in situ, анализ генетического сцепления; их разрешающая способность ограничена 1000–5000 т. п.н. ............
