Введение
К концу 70-х годов перед исследователями, работавшими в сфере молекулярной биологии, остро встала проблема установления последовательности нуклеотидов в цепи ДНК («секвенирования ДНК»). Как подойти к решению этой проблемы? За 10 лет до того Эрдманом и Беггом была решена задача выяснения последовательности аминокислот в белках («секвенирования белков») в автоматическом режиме. С этим решением мы уже ознакомились. Собственно говоря, новым в их методе был только способ автоматизации. Существо же этого метода было для химии тривиальным. Был найден способ последовательного отщепления по одной аминокислоте (хотя и в модифицированном виде) от конца изучаемой белковой цепи с последующей идентификацией каждого из полученных таким образом простых продуктов.
Отыскание аналогичного подхода для секвенирования ДНК не вдохновляло исследователей, поскольку для секвенирования хотя бы одного структурного гена предстояло определять последовательность в 1—3 тысячи нуклеотидов, не говоря уже о всем геноме, когда счет должен идти на миллионы, а у высших организмов на миллиарды нуклеотидов.
Первоначальные способы не автоматизированного секвенирования ДНК
В 1977 году Максам и Гилберт предложили совершенно иной, оригинальный метод решения проблемы секвенирования. Им удалось найти химическую реакцию, которая расщепляла молекулу ДНК по месту расположения одного определенного нуклеотида. Они помечали радиоактивной меткой первый нуклеотид исследуемого однонитевого (после денатурации) фрагмента ДНК, представленного, разумеется, огромным количеством копий. Затем проводили реакцию расщепления в таких условиях, что подавляющее большинство нитей ДНК разрывалось только в одном из множества мест, где стоял избранный нуклеотид (а все эти места равноправны). После этого продукты расщепления направлялись для анализа методом электрофореза в ПААГ. Ауторадиография геля выявляла следующую картину.
Отрезки ДНК всех возможных размеров, считая от начала молекулы до известного (подвергшегося химической атаке) нуклеотида, разделились и обнаружили себя полосами почернения рентгеновской пленки. Самые короткие отрезки (в 2, 3 и даже один первый нуклеотид) ушли в геле далеко вперед. Более длинные отрезки отстали тем сильнее, чем они были длиннее. Степень почернения полос оказалась разная, поскольку число молекул ДНК, разорвавшихся в каждом из возможных мест было случайным. Но при достаточном количестве исходного материала все они были хорошо видны. «Отрезанные» части молекул, напротив, ничем себя в геле не проявляли, так как не содержали меченого нуклеотида.
Эта картина еще не несла в себе никакой информации о порядковых номерах нуклеотидов, по которым произошел разрыв. Однако аналогичные специфические реакции расщепления авторам удалось найти и для трех остальных нуклеотидов. Они смогли получить соответствующие картины разделения отрезков ДНК и для них. Затем они вели электрофоретическое разделение одновременно для всех 4-х случаев в параллельных треках одного геля. Из сопоставления положений всех полос оказалось возможным получить полную информацию о последовательности нуклеотидов в исследуемом фрагменте ДНК. Действительно, все полосы в 4-х треках должны находиться на разных уровнях, потому что длины соответствующих этим полосам отрезков ДНК будут различаться между собой хотя бы на один нуклеотид. ............
