БИОТЕХНОЛОГИЯ
Физиологическая адаптация нового RuMP штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum к тяжелой воде
@ 2006 О. В. МОСИН
Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова, 117571, Москва, просп. Вернадского, 86.
Разработан метод физиологической адаптации нового фенилаланин-продуцирующего RuMP штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum к максимальным (98 об.%) концентрациям 2Н2О с целью последующего микробиологического синтеза 2Н-меченого фенилаланина. Метод заключается в последовательном рассеве штамма на агаризованных средах М9 с 2 об.% [U -2Н] MetOH со ступенчато возрастающим градиентом концентрации 2Н2O (от 0 до 98 об.% 2Н2О) и последующей селекцией колоний по признаку устойчивости к 2Н2О. В результате применения разработанного подхода для данного штамма метилотрофных бактерий на среде с 98 об.% 2H2О были отобраны отдельные колонии, сохранившие высокие ростовые и биосинтетические параметры. За счет использования адаптированного штамма можно получить 0.95 грамм 2Н-меченого фенилаланина с 1 литра ростовой среды. Показано, что наряду с фенилаланином штамм синтезирует и выделяет в ростовую среду в количестве 5-6 ммоль метаболически связанные с ним аминокислоты: аланин, валин и лейцин/изолейцин. Согласно данным метода масс-спектрометрии EI MS метиловых эфиров N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных (Dns) производных аминокислот, 2Н-меченые аминокислоты, полученные микробиологическим синтезом представляли собой смеси молекул с различным количеством включенных атомов дейтерия; уровень дейтерированности молекул определяли из масс-спектров по наиболее распространенному пику молекулярного иона (M)+ каждой аминокислоты - для фенилаланина уровень дейтерированности составил 6; для аланина -3.1; для валина -4.7; для лейцина/изолейцина - 5.1 атома дейтерия.
ВВЕДЕНИЕ
В настоящее время микробиологический синтез 2Н-меченых аминокислот привлекает все большее внимание исследователей вследствие исключительно природной конфигурации синтезируемых соединений, возможностью униформного введения дейтериевой метки в молекулы аминокислот и их низкой стоимости по сравнению с химически синтезированными аналогами [1, 2]. Именно поэтому поиск новых штаммов-продуцентов 2Н-меченых аминокислот, устойчивых к высоким концентрациям дейтерия в ростовых средах для их дальнейшего микробиологического использования является актуальной задачей для современной микробиологической промышленности.
С развитием новых биотехнологических подходов появилась возможность использовать для направленного синтеза 2Н-меченых аминокислот биологическую конверсию [U- 2H]MetOH в клетках полученных за счет мутагенеза и генной инженерии штаммов метилотрофных бактерий, ассимилирующих MetOH в качестве источника углерода и энергии по рибулозомонофосфатному (RuMP) или сериновому пути ассимиляции углерода [3]. Продуктивность метилотрофных бактерий, измеренная по уровню конверсии MetOH в клеточные компоненты достигает 50%, что делает их удобными объектами для получения с их помощью 2Н-меченых аминокислот [4]. Традиционным подходом при этом остаётся выращивание метилотрофных штаммов-продуцентов аминокислот на минеральных средах с [U- 2Н]MetOH и максимальными концентрациями 2Н2О [5]. ............
