Скорость осаждения частиц
Под словом «частица» условимся подразумевать (если об этом пойдет речь) и крупные макромолекулы белков или нуклеиновых кислот.
1. При одинаковых плотностях частицы большего размера оседают намного быстрее, чем мелкие .
2. Скорость оседания («седиментации») увеличивается с увеличением плотности частиц. Особенно сильно это проявляется в условиях, когда плотность среды близка к плотности частицы. Возможна ситуация, когда мелкие, но более плотные частицы будут оседать быстрее, чем крупные.
3. Скорость оседания частиц пропорциональная квадрату числа оборотов ротора в минуту.
4. Чем больше вязкость среды, тем медленнее оседание частиц.
5. Скорость седиментации пропорциональна расстоянию частицы от оси вращения ротора. Это расстояние увеличивается по мере продвижения частицы вдоль оси пробирки, поэтому при постоянстве прочих условий скорость седиментации должна непрерывно (хотя и медленно) возрастать. Если это нежелательно, то следует повышать плотность или вязкость среды в радиальном направлении так, чтобы они компенсировали увеличение радиуса вращения.
Имеет смысл ввести понятие «плавучей плотности» частиц. Дело в том, что проявляющая себя при ультрацентрифугировании плотность частицы обусловлена не только ее химическим составом и пространственной структурой. К примеру, она сильно зависит от степени «гидратации» частицы — количества прочно связанной с ней воды. Эта вода движется вместе с частицей, значительно уменьшая ее эффективную плотность. Количество этой воды заметно уменьшается в присутствии высоких концентраций ионов или иных гидрофильных молекул, тоже связывающих воду (свободной воды не хватает!). С другой стороны, некоторые ионы или молекулы могут сами прочно связываться с частицами, увеличивая их эффективную плотность.
Поэтому для данного типа частиц, оседающих в данной среде, вводят понятие «плавучей плотности». Ее можно определить экспериментально, измерив плотность среды в точке, где движение частицы прекращается ввиду равенства нулю скобки в формуле 1 (см. ниже — «равновесное ультрацентрифугирование»).
Наконец, отклонение формы частицы от сферической тоже сказывается (не очень сильно) на скорости их оседания. В связи с этим стоит напомнить, что как макромолекулы белков, так и молекулы достаточно высокополимерных нуклеиновых кислот в растворе сворачиваются в хаотические клубки, форма которых близка к сферической.
Раздельное осаждение частиц
Предположим, что из гомогената клеток, уже освобожденного низкоскоростным центрифугированием от ядра, митохондрий и обрывков наружной оболочки, требуется выделить рибосомы, внутренние мембраны и еще более мелкие частицы. Можно так подобрать умеренную скорость вращения углового ротора (при значительном объеме пробирок), что в осадок попадут только самые крупные частицы, даже те из них, которые вначале находились вблизи мениска. Менее крупные частицы при этом почти полностью останутся в надосадочной жидкости (супернатанте), за исключением тех, которые с самого начала уже находились у дна пробирки — они войдут в состав осадка. Для хорошей очистки крупных частиц супернатант осторожно сливают, осадок вновь суспендируют (в буфере) в полном объеме пробирки и снова центрифугируют в тех же условиях. ............
