Потенциометрический и амперометрический иммуноанализ
Введение
Меченные ферментом антитела стали получать с середины шестидесятых годов. Сначала их использовали для визуального обнаружения антигенов в гистологии и линий преципитации в иммуноэлектрофорезе. Количественное определение иммунореагентов с помощью ферментной метки стало возможным после разработки способов иммобилизации антигенов на твердой подложке. Этим работам предшествовало внедрение в иммуноанализ в качестве меток радиоактивных изотопов, и в то, время ферменты казались менее перспективными метками. Радиоиммуноанализ широко применялся в клинических анализах благодаря хорошей чувствительности и достаточной селективности. В настоящее время все чаще стали обсуждать недостатки РИА, связанные, например, с коротким периодом полураспада йода-125 и проблемами захоронения радиоактивных отходов. Однако простота измерения радиоактивной метки при удовлетворительных чувствительности и точности первоначально обеспечивала методу РИА некоторые преимущества перед методом иммуноферментного анализа. Примерно в то же время впервые было описано применение электродов для определения биологических молекул. Первые электроды создавались исключительно на основе ферментов в силу их высокой специфичности к субстратам. Были разработаны ферментные электроды для определения многих компонентов биологических жидкостей, например глюкозы и мочевины. К сожалению, ферменты не обязательно абсолютно специфичны по отношению только к одному субстрату, и поэтому всегда есть вероятность мешающего влияния со стороны других биологических компонентов проб. Несмотря на недостаточную специфичность, ферментные электроды, как и другие электрохимические детекторы, имеют и ряд положительных качеств, в первую очередь относительно низкую стоимость и простоту в эксплуатации. Кроме того, для них характерен низкий предел обнаружения, в ряде случаев приближающийся к пределу обнаружения с помощью РИА.
Электрохимические методы иммуноанализа создавались с целью объединения чувствительности электрохимического детектора и специфичности, присущей реакции взаимодействия антиген-антитело. Существуют два типа электрохимических сенсоров:
амперометрические, в которых потенциал электрода инициирует реакцию й измеряется сила тока;
потенциометрические, в которых на границе раздела сенсор-раствор устанавливается локальное равновесие и измеряется мембранный или электродный потенциал.
В потенциометрическом иммуноанализе доминируют три направления: прямое определение степени связывания белков;
использование ионо- и газоселективных электродов для определения продуктов иммунохимической реакции с ферментной меткой;
включение ионофоров в мембраны ионоселективных электродов.
В большинстве ранних публикаций по протенциометрическим ферментным детекторам описаны связанные с мембраной антигены и их применение для определения специфических антител. Присоединением ионофора к антигену можно достичь усиления выходного сигнала. В более поздних публикациях описаны сенсоры и для определения антигенов, на мембране которых в свою очередь иммобилизованы антитела.
Амперометрические иммуноанализы подразделяют на два основных типа:
1) анализы с использованием ферментных меток, которые катализируют образование электрохимически активного продукта;
2) анализы, в которых сама метка электроактивна или придает электроактивность другим веществам, например путем присоединения нитрогрупп.
Иногда выделяют также вольтамперрметрический иммуноанализ с металлоценовыми метками. ............
